碳納米管 (CNT) 在電子、材料科學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用引起了人們的極大興趣。然而，由于它們可能具有毒性和在自然界中的持久性，國際化學(xué)秘書處 (ChemSec) 最近將 CNT 添加到 SIN（“立即替代”）化學(xué)品清單中，建議在未進(jìn)行人體健康風(fēng)險(xiǎn)評估的情況下不應(yīng)使用 CNT。因此，需要額外的努力來了解CNT與可能誘發(fā)炎癥和控制毒性的人類分子之間的相互作用。這些知識對于設(shè)計(jì)和開發(fā)更安全的 CNT 至關(guān)重要。

先前的報(bào)告表明，長而硬的多壁碳納米管 (MWCNT) 在嚙齒動物中具有類似石棉的致病性。與石棉一樣，在腹腔注射后，多壁碳納米管優(yōu)先被巨噬細(xì)胞吞噬，隨后的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)被認(rèn)為會引起慢性炎癥，從而導(dǎo)致間皮瘤。事實(shí)上，體外研究表明，MWCNT 和石棉都會立即被巨噬細(xì)胞吞噬并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡和 Nlrp3 炎性體激活，從而導(dǎo)致白細(xì)胞介素 1β (IL-1β) 分泌。然而，人們對巨噬細(xì)胞如何識別其細(xì)胞表面的多壁碳納米管知之甚少。

近日，研究人員將 T 細(xì)胞粘蛋白免疫球蛋白 (Ig) 4 (Tim4) 和 Tim1 磷脂酰絲氨酸受體鑒定為小鼠中的CNT識別受體。這些受體的獨(dú)特之處在于它們在其頂端位置具有一簇芳香族殘基，有助于直接識別 CNT。值得注意的是，通過抗Tim4單克隆抗體 (mAb) 掩蔽Tim4或Tim4基因缺失可改善CNT誘導(dǎo)的腹膜炎癥和肉芽腫形成，突出了巨噬細(xì)胞吞噬 CNT 在其毒性中的關(guān)鍵作用。然而，在人類中，尚不清楚 Tim4 是否參與此過程，因?yàn)?Tim4 mRNA 水平在人外周血單核細(xì)胞 (PBMC) 和肺組織中處于邊緣狀態(tài)。

之前，研究人員使用了長而硬的多壁碳納米管（132 ± 47 nm× 5.1 ± 2.4 μm）對其進(jìn)行了詳細(xì)表征，并觀察到人外周血（PB）單核細(xì)胞有效地吞噬了這些MWCNT，然后分泌IL-1β， 盡管 Tim4 和Tim1 都不在其細(xì)胞表面表達(dá)。因此，這表明存在未知的人類 CNT 識別受體。 鑒于 Tim4 和 Tim1 的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，其頂端包含一簇芳香殘基，研究人員假設(shè)這樣的簇對于 CNT 識別至關(guān)重要。因此，在目前的工作中，立命館大學(xué)Masafumi Nakayama、日本煙草公司Kota Kasahara等研究人員主要是尋找含有芳香簇的Tim4樣受體。

計(jì)算機(jī)篩選和 AlphaFold 建模將Siglec-5 和 Siglec-14 識別為 CNT 結(jié)合受體

研究人員進(jìn)行了基于三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)篩選。通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)和 GO分析，以及視覺篩選，以識別在其頂端位置含有此類簇的 Tim4 樣受體，并最終分離出唾液酸 Ig 樣結(jié)合凝集素 (Siglec)-5 和 Siglec-3。

盡管已知 Siglec 受體可以識別各種含唾液酸的聚糖并在免疫細(xì)胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但它們是否識別 CNT 仍然未知。因此，研究人員用人 Siglec-5 或 Siglec-3 重建了 NIH-3T3 細(xì)胞。引人注目的是，Siglec-5而非Siglec-3 的表達(dá)使 NIH-3T3 細(xì)胞能夠識別 MWCNT。此外，Siglec-5/NIH-3T3 細(xì)胞的 MWCNT 結(jié)合活性高于Tim4/NIH-3T3 細(xì)胞。

圖|將 Siglec-5 鑒定為 CNT 識別受體

研究人員并使用MD模擬和體外結(jié)合試驗(yàn)來解析其結(jié)合過程。研究人員調(diào)查了兩個(gè) Siglec-5 突變體 WY50/51AA 和 WYYY50/51/68/69AAA，以檢查這些芳香簇對結(jié)合的重要性。結(jié)果表明，這兩種芳族簇加起來有助于識別 CNT 表面，并且它們的損失會導(dǎo)致結(jié)合的顯著不穩(wěn)定。因此，這突出了一種由多種芳香-芳香相互作用介導(dǎo)的新型納米-生物界面。

圖|MD 模擬和體外驗(yàn)證以闡明 Siglec-5 與 MWCNT 的結(jié)合模式

研究人員還探索了其他 Siglec 是否也能識別 CNT。研究發(fā)現(xiàn)，Siglec-14 的 V 組 Ig 樣結(jié)構(gòu)域與 Siglec-5 具有 100% 的氨基酸同一性，不出所料，Siglec-14 和 Siglec-5 的表達(dá)使細(xì)胞能夠識別 MWCNT。

圖|Siglec-14，而不是 Siglec-5，吞噬多壁碳納米管以誘導(dǎo) IL-1β 分泌和肺部炎癥

Siglec-14 介導(dǎo) MWCNT 的吞噬作用并引發(fā)炎癥

值得注意的是，Siglec-14 通過帶有基于酪氨酸的激活基序 (ITAM) 的 DAP12 傳遞激活信號，因此 Siglec-14 可能參與 MWCNT 誘導(dǎo)的炎癥。相反，Siglec-5 在細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中具有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序 (ITIM)，因此可以抑制炎癥。為了解決這些配對受體的功能，研究人員構(gòu)建了 THP-1細(xì)胞，一種穩(wěn)定表達(dá) Siglec-5 或 Siglec-14 的人單核細(xì)胞系。有趣的是，Siglec-14 被發(fā)現(xiàn)介導(dǎo) NF-κB 激活，如 IκB-α 的瞬時(shí)降解所示，并誘導(dǎo) IL-8 分泌以響應(yīng) MWCNT。另一方面，Siglec-5 對這些促炎反應(yīng)沒有顯著影響?？傊?，這些結(jié)果表明 Siglec-14 響應(yīng)于 MWCNT 傳遞炎癥信號。值得注意的是，Siglec-14 蛋白被 MWCNT 下調(diào)，而 Siglec-5 蛋白的表達(dá)沒有變化?？紤]到細(xì)胞表面 Siglec-14 的快速下調(diào)，該受體可能被內(nèi)化和降解。實(shí)際上，盡管在 MWCNT 識別方面，Siglec-5 和 Siglec-14 之間沒有顯著差異，但 Siglec-14 顯著誘導(dǎo)了 MWCNT 的吞沒，而 Siglec-5 僅結(jié)合 MWCNT。

為了解決 Siglec-14 的體內(nèi)作用，研究人員通過使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)生成了在約 30% 的 Siglec-F⁺ 肺泡巨噬細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá) Siglec-14 的小鼠。當(dāng)這些小鼠氣管內(nèi) (i.t.) 注射多壁碳納米管時(shí)，Siglec-14轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨噬細(xì)胞在體內(nèi)比未轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨噬細(xì)胞更有效地識別多壁碳納米管。注射后第 1 天，與模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠相比，Siglec-14 轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠的支氣管肺泡灌洗液 (BALF) 中的 IL-1β顯著增加。與此一致，肺組織的H&E染色顯示在 Siglec-14 轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠的肺泡腔中有炎癥細(xì)胞積聚。總之，這些結(jié)果表明 Siglec-14 介導(dǎo)肺部炎癥以響應(yīng) MWCNT。

圖|Siglec-14 介導(dǎo)的人單核細(xì)胞對多壁碳納米管的識別

Syk抑制劑福他替尼減弱Siglec-14 介導(dǎo)的對多壁碳納米管的炎癥反應(yīng)

鑒于脾臟酪氨酸激酶 (Syk) 可能參與 Siglec-14-DAP12 信號傳導(dǎo)，研究人員使用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)生成了 Syk 無效細(xì)胞。Syk缺失不影響 Siglec-14 的細(xì)胞表面表達(dá)，但會顯著降低 MWCNT 的吞噬作用和隨后的 IL-1β 分泌，表明 Syk 信號傳導(dǎo)的重要作用。這一發(fā)現(xiàn)促使研究人員解決 Syk 是否可以成為治療目標(biāo)的問題。正如所料，R406 是 FDA 批準(zhǔn)的 Syk 抑制劑福他替尼 R788 的活性代謝物，它以劑量依賴的方式顯著阻斷 S14^+/-供體 PBMC 以及 Siglec-14/THP-1 細(xì)胞分泌 IL-1β。另一方面，R406 不影響尼日利亞菌素或 ATP 誘導(dǎo)的 IL-1β 分泌，排除了非特異性毒性作用的可能性。此外，口服 R788 可顯著降低 MWCNT 誘導(dǎo)的 Siglec-14 轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠 BALF 中 IL-1β 和 TNF-α 的分泌。這些數(shù)據(jù)表明，福他替尼在體外和體內(nèi)抑制 Siglec-14 介導(dǎo)的對多壁碳納米管的炎癥反應(yīng)。

Siglec-14-Syk 介導(dǎo)的對多壁碳納米管的炎癥反應(yīng)被福他替尼阻斷

多壁碳納米管與單壁碳納米管的毒性差異

與多壁碳納米管相比，單壁 (SW) 碳納米管被認(rèn)為毒性較低。因此，作者還評估了單壁碳納米管的生物學(xué)效應(yīng)。WCNT連接 Siglec-14 以誘導(dǎo) IL-8 分泌，但內(nèi)化的 SWCNT 不會引起溶酶體損傷和相關(guān)的 IL-1β 分泌。另一方面，據(jù)報(bào)道，單壁碳納米管會導(dǎo)致線粒體損傷。因此，細(xì)胞內(nèi)事件而非細(xì)胞表面識別可以解釋 MWCNT 和 SWCNT 之間的毒性差異。

小結(jié)

綜上所述，研究人員證明 Siglec-14 通過細(xì)胞外芳香簇識別 CNT，從而引發(fā)炎癥。值得注意的是，據(jù)報(bào)道碳納米材料通過芳香-芳香相互作用結(jié)合可溶性蛋白質(zhì)的芳香基團(tuán)，其方式與 Siglec-5/14-CNT 相互作用相同。因此，Siglec-14 可能與蛋白冠的芳香基團(tuán)競爭或結(jié)合，以分別直接或間接識別 CNT。因此，這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了芳香簇在 Siglec 分子的受體細(xì)胞外環(huán)中對 CNT 識別的重要性。

CNT是具有廣泛潛在應(yīng)用的創(chuàng)新工具，大多數(shù)人可能會對它們產(chǎn)生反應(yīng)。Anti-Siglec-14 mAb 和福他替尼可能是控制 CNT 毒性的治療和預(yù)防工具。

參考文獻(xiàn)：

Yamaguchi, SI., Xie, Q., Ito, F. et al. Carbon nanotube recognition by human Siglec-14 provokes inflammation. Nat. Nanotechnol. (2023). 

https://doi.org/10.1038/s41565-023-01363-w

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